تقریبا تمام کمپنیاں ہیں جنہوں نے فروخت کیابرومیلین انزائم پاؤڈرپاپین کے ساتھ ملایا جاتا ہے۔ برومیلین کو 5000GDU/g تک صاف کرنا مشکل ہے۔ لیکن پاپین کو 1000,000GDU/g تک صاف کرنا بہت آسان ہے۔ یہاں تک کہ 2000,000GDU/g تک۔ لیکن برومیلین کے افعال پاپین سے مختلف ہیں۔ رنگ، ترتیب، پانی میں حل پذیری، اور ذائقہ جعلی پروڈکٹ اور حقیقی پروڈکٹ کے برعکس ہے۔ وہ فرق ہیں صحیح برومیلین اینزائم پاؤڈر سرمئی، بو کے بغیر، بے ذائقہ اور پانی میں حل نہ ہونے والا ہے۔
لیکن جھوٹے برومیلین میں درج ذیل خصوصیات ہیں:
● یہ ہلکا پیلا، خوشبودار اور ہلکا میٹھا، اور پانی میں حل پذیر ہے۔ یہ پاپین کی خصوصیت ہے۔
● یہ سوزش کو کم کرنے اور درد کو دور کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ لیکن papain میں یہ افعال تقریباً نہیں ہیں۔
● یہ صرف غذائی ضمیمہ کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، کھانے میں اضافے کے لیے نہیں، لیکن درحقیقت فارما گریڈ ہو سکتا ہے۔ لیکن پاپین صرف گوشت کے ٹینڈرائزر پاؤڈر اور کاسمیٹکس کے طور پر استعمال ہوتا ہے۔
ہم نے SDS-PAGE جیل اور GELATIN DIGESTION UNIT ANALYTICAL اور HPLC طریقوں کے مطابق برومیلین کا تجربہ کیا، جعلی پروڈکٹ کے لیے SDS-PAGE جیل کے طریقہ کار میں ہدف کے مالیکیولز کم ہیں۔
ایس ڈی ایس پیج الیکٹروفورسس کے نتائج درج ذیل ہیں۔
اوپر دیے گئے دھبے سے ظاہر ہوتا ہے کہ تصویر میں صحیح جگہ پر صرف صحیح پروڈکٹ کا وہی دھبہ ہوتا ہے، لیکن جعلی پروڈکٹ پر چھوٹے دھبے ہوتے ہیں، یعنی مالیکیولر وزن بمشکل نظر آتا ہے۔
برومیلین کا مالیکیولر وزن تقریباً 33000 ہے، لیکن پاپین کا سالماتی وزن 21000 ہے۔ اور HPLC کرومیٹوگرام:
آپ دیکھیں گے کہ صرف صحیح نچوڑ میں برومیلین کا صحیح سالماتی وزن ہوتا ہے اور یہ HPLC کے ذریعہ قابل شناخت ہے۔
لیکن اگر ہم صرف جیلیٹن ڈائجشن یونٹ اینالیٹیکل میتھڈ (GDU) کے ذریعے جانچتے ہیں تو انیکس II دیکھیں۔ صحیح اور غلط دونوں پروڈکٹ کے وہی نتائج ہیں جو ذیل میں ہیں:
انناس کا تنا بہت سستا ہے، اور تنے سے برومیلین تک کی شرح بہت کم ہے، مینوفیکچرنگ کے عمل میں کچھ آلودگی ہوتی ہے۔
تقریبا تمام برومیلین انزائم پاؤڈر فیکٹری فیلڈ کے قریب ہیں۔ وہ تازہ تنا استعمال کرتے ہیں۔ تنے کو لمبی دوری پر بھیجنا ناممکن ہے۔ خام مال کو جلد از جلد سنبھال لیا جانا چاہئے جب اسے کھیت میں جمع کیا جائے یا اسے کم درجہ حرارت والے ماحول (4-8 ڈگری) میں ذخیرہ کیا جانا چاہئے تاکہ پروٹین کی کمی سے بچا جا سکے۔ حقیقی زندگی میں، مینوفیکچرر درحقیقت بہت زیادہ انناس کے تنوں کی وجہ سے مذکورہ بالا دو شرائط میں سے کسی کو پورا نہیں کر سکتا۔ مناسب طریقہ وقت اور پروٹین کی سرگرمی کے نقصان کو سنبھالنے کے درمیان توازن ہے۔ عام طور پر، انناس کی کٹائی کے موسم میں خام خام مال کی تیاری، اور خام خام مال کو کم درجہ حرارت والے ماحول (4-8 ڈگری) میں ذخیرہ کرتے ہیں۔
ہم ایس ڈی ایس پیج الیکٹروفورسس کے بارے میں کچھ ٹیسٹ کر رہے ہیں، نظریہ میں ہم اسے 10،000 یا 20،000 تک بڑھا سکتے ہیں۔لیکن یہ بہت مہنگا ہوگا۔ 5000GDU/g اور اسے مالٹو سپورٹ / مائیکرو این کیپسولیٹڈ ایک یا کسی چیز کے علاوہ آرگینک گریڈ نکالنے / پیوریفیکیشن پر مستحکم بنائیں۔
ملحقہ I
● طریقہ 5 SDS پولی کریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس (SDS-PAGE)
SDS-PAGE ایک منحرف پولی کریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس طریقہ ہے۔ اس طریقہ کار میں پروٹین کی علیحدگی کا اصول اس حقیقت پر مبنی ہے کہ زیادہ تر پروٹین anionic surfactant سوڈیم dodecyl سلفیٹ (SDS) کے ساتھ وزن کے تناسب میں مل کر ایک کمپلیکس تشکیل دے سکتے ہیں۔
پروٹین کے مالیکیولز کے ذریعے لے جانے والا منفی چارج قدرتی پروٹین مالیکیولز کے خالص چارج سے کہیں زیادہ ہے، مختلف پروٹین مالیکیولز کے چارج اثر کو ختم کرتا ہے اور پروٹین کو ان کے مالیکیولر سائز کے مطابق الگ کرتا ہے۔
یہ طریقہ معیار کی شناخت، پاکیزگی اور نجاست پر قابو پانے اور پروٹین کے مقداری تعین کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
1 ساز کا آلہ
مستقل وولٹیج یا مستقل کرنٹ پاور سپلائی، عمودی پلیٹ الیکٹروفورسس ٹینک، اور چپکنے والا مولڈ۔
2. ری ایجنٹس
(1) پانی۔
(2) علیحدگی جیل بفر (4x، حل A) 1.5mol/L trihydroxymethyl aminomethane ہائیڈروکلورک ایسڈ بفر۔ 18.15 گرام ٹرائی ہائیڈروکسی میتھائل امینو میتھین کا وزن کریں اور اسے مناسب مقدار میں پانی سے تحلیل کریں۔ ہائیڈروکلورک ایسڈ کے ساتھ پی ایچ ویلیو کو 88 پر ایڈجسٹ کریں اور پانی کے ساتھ 100 ملی لیٹر تک پتلا کریں۔
(3) وزن 580g ایکریلامائڈ اور 20 گرام N, N' - میتھیلین بیساکریلامائڈ 30 فیصد ایکریلامائڈ محلول (B محلول) میں، گرم پانی میں گھول کر 200 ملی لیٹر تک پتلا کریں، فلٹر پیپر کے ساتھ فلٹر کریں (اس میں محفوظ کریں) تاریک)۔
(4) 10 فیصد SDS محلول (C محلول) میں 10 گرام سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ کا وزن کریں، پانی میں تحلیل کریں، اور 100 ملی لیٹر تک پتلا کریں۔
(5) tetramethylethylenediamine محلول (TEMED، D محلول) کا کمرشلائزیشن ری ایجنٹ۔
10 فیصد امونیم پرسلفیٹ محلول (E محلول) 10 گرام امونیم پرسلفیٹ کا وزن، پانی میں تحلیل کریں، اور 100 ملی لیٹر تک پتلا کریں۔ اسے استعمال کرنے سے پہلے تیار کرنے یا 2 ہفتوں تک -20 ڈگری پر الگ سے ذخیرہ کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔
(7) مرتکز ربڑ کا بفر (4 ×، F محلول) 0.5mol/L Trihydroxymethylaminomethane Hydrochloric acid buffer، وزن 6.05g Trihydroxymethylaminomethane، پگھلنے کے لیے مناسب مقدار میں پانی شامل کریں، pH قدر کو ہائیڈروکلورک کے ساتھ 6.8 پر ایڈجسٹ کریں۔ تیزاب، اور پانی سے 100 ملی لیٹر تک پتلا کریں۔
(8) الیکٹروڈ بفر (10 ×) کا وزن 30 گرام ٹرائیمیتھائیلامینو میتھین، 144 گرام گلائسین، اور 10 گرام سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ، انہیں پانی میں تحلیل کریں اور تقریباً 800 ملی لیٹر تک پتلا کریں۔ پی ایچ ویلیو کو ہائیڈروکلورک ایسڈ کے ساتھ 8۔
(9) غیر کم شدہ نمونہ بفر (4 ×) وزن 303 گرام ٹرائیمیتھائیلامینومیتھین، 20 ملی گرام بروموفینول بلیو، اور 8.0 گرام سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ، 40 ملی لیٹر گلیسرول کی پیمائش، پانی میں گھل کر تقریباً 80 ملی لیٹر تک پتلا کریں۔ ہائیڈروکلورک ایسڈ کے ساتھ پی ایچ کو 68 پر ایڈجسٹ کریں، اور پانی سے 100 ملی لیٹر تک پتلا کریں۔
(8) الیکٹروڈ بفر (10 ×) کا وزن 30 گرام ٹرائیمتھائیلامینو میتھین، 144 گرام گلائسین، اور 10 گرام سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ، پانی میں گھل جاتا ہے اور تقریباً 800 ملی لیٹر تک پتلا ہوتا ہے۔ ڈی ایچ ویلیو کو ہائیڈروکلورک ایسڈ کے ساتھ 81-88 میں ایڈجسٹ کریں، اور پانی سے 1000 ملی لیٹر تک پتلا کریں۔
(9) غیر کم شدہ نمونہ بفر (4 ×) وزن 3.03 گرام ٹرائیمیتھائیلامینومیتھین، 20 ملی گرام بروموفینول بلیو، اور 80 گرام سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ، 40 ملی لیٹر گلیسرول کی پیمائش کریں، پانی میں گھل جائیں، اور تقریباً 80 ملی لیٹر تک پتلا کریں۔ ہائیڈروکلورک ایسڈ کے ساتھ پی ایچ کو 6.8 پر ایڈجسٹ کریں، اور پانی سے 100 ملی لیٹر تک پتلا کریں۔
(10) کم ٹیسٹ مادہ بفر (4 ×) وزن 3.03g trimethylaminomethane، 20mg bromophenol blue، اور 80g sodium dodecyl سلفیٹ، 40ml glycerol کی پیمائش کریں، پانی میں گھلائیں اور پتلا کریں اور تقریباً 80ml میں شامل کریں۔ - 20ملی لیٹر مرکاپٹوتھانول، ہائیڈروکلورک ایسڈ کے ساتھ پی ایچ کو 6.8 پر ایڈجسٹ کریں، پانی سے 100 ملی لیٹر (یا 3.03 گرام ٹرائیمیتھائیلامینومیتھین، 20 ملی گرام بروموفینول بلیو، 8.0 گرام سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ، پانی میں 40 ملی لیٹر ڈائیسول، ڈائی سولویلیو کی پیمائش کریں) 80 ملی لیٹر تک، ہائیڈروکلورک ایسڈ کے ساتھ پی ایچ کو 6.8 پر ایڈجسٹ کریں، پانی سے 100 ملی لیٹر تک پتلا کریں، اور استعمال سے پہلے، ڈیتھیوتھریٹول کو 100 ملی میٹر/ ایل میں شامل کریں)۔
● ضمیمہ II
جیلیٹن ہاضمہ یونٹ تجزیاتی طریقہ (GDU)
A. مقصد: یہ طریقہ کار برومیلین اینزائم پاؤڈر کی پروٹولوٹک سرگرمی کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
B. سامان:
1. پی ایچ میٹر
2. 45 پر مستقل درجہ حرارت پانی کا غسل۔{2}} ڈگری ± 0.1 ڈگری
3. تجزیاتی توازن
4. والیومیٹرک فلاسکس
5. والیومیٹرک پائپیٹ
6. ٹائمر
7. ڈیجیٹل بیریٹ (0.1 ملی لیٹر کی درستگی)
8. فوم ہڈ
9. خودکار پائپٹرز
C. حفاظتی احتیاطیں:
یہ ٹیسٹ فیوم ہڈ میں کیا جانا چاہیے۔
1. معیاری لیبارٹری کے حفاظتی طریقوں کو استعمال کریں۔
2. Formaldehyde: تیار کریں اور ہر وقت فیوم ہڈ میں رکھیں۔ معروف کارسنجن اور ٹیراٹوجن۔
3. پیرو آکسائیڈ: مضبوط آکسیڈائزر
D. ریجنٹس اور ری ایجنٹ کی تیاری:
1. آست پانی: تقریباً 500 ملی لیٹر: 0.1 N HCI کے ساتھ 4.5 کے pH میں ایڈجسٹ کریں۔
2. جیلیٹن سبسٹریٹ:
a 375 ملی لیٹر گرم پانی میں 25 گرام جیلیٹن (مائکروبائیولوجی 1.04070) کو گھول کر ابال لیں۔ 45 ڈگری تک ٹھنڈا کریں۔
ب pH کو 0.1 N HCI کے ساتھ 4.5 پر ایڈجسٹ کریں اور 500 ملی لیٹر pH 4.5 ڈسٹل واٹر پر پتلا کریں۔
c جیلیٹن سبسٹریٹ کو 45 ڈگری پر رکھیں۔
3. بفر حل:
a 150 ملی لیٹر بیکر میں 15 گرام NaCl آہستہ آہستہ 40-50 ملی لیٹر پانی میں ڈالیں اور گھلنے کے لیے ہلائیں۔
ب 0.570 ملی لیٹر ایسٹک ایسڈ شامل کریں۔
c 0.2N HCL کے ساتھ pH کو 4.5 پر ایڈجسٹ کریں (حجم 100ml سے زیادہ ہوگا۔)
4. 3 فیصد ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ:
a پائپیٹ 2.5 ملی لیٹر 30 فیصد ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ (اسٹاک محلول) کو 25 ملی لیٹر والیومیٹرک فلاسک میں ڈالیں اور پی ایچ 4.5 ڈسٹل واٹر کے ساتھ حجم میں پتلا کریں۔
5. 37 فیصد Formaldehyde pH 9۔{3}}: a. فارملڈہائیڈ کی کافی مقدار (100 ملی لیٹر) کو 0.1 N NaOH کے ساتھ pH 9.0 میں ایڈجسٹ کریں (pH ایڈجسٹمنٹ سے پہلے تقریباً 20 ملی لیٹر فارملڈہائڈ فی نمونہ۔)
جیلیٹن ہاضمہ یونٹ تجزیاتی طریقہ (GDU) - جاری ہے۔
6. 0.100 N NaOH: (معیاری خریدا ہوا) a. اسٹاک حل: 0.100 N پر معیاری
E. طریقہ کار:
1. انزائم کی تیاری:
a ینجائم کی تیاری کا حساب لگانا
وزن {{0}}/ہدف کی سرگرمی (تقریبا 0.05 گرام یا 50 ملی گرام)
A. انزائم کا وزن 50 ملی لیٹر والیومیٹرک فلاسک میں درست طریقے سے کریں۔
B. 8.3 ملی لیٹر بفر محلول شامل کریں۔
ب کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ کھڑے رہنے دیں۔
C. pH 4.5 ڈسٹل واٹر کا استعمال کرتے ہوئے 50 ملی لیٹر تک پتلا کریں، ایک چھوٹی سی اسٹر بار ڈالیں اور مزید 10 سے 15 منٹ تک ہلائیں۔
2. انزائم کا طریقہ کار:
a 25 ملی لیٹر جیلیٹن سبسٹریٹ کو دو 100 ملی لیٹر بیکروں میں ڈالیں جن میں اسٹر بارز ہوں اور انہیں 45 ڈگری پر 5 منٹ کے لیے پانی کے غسل میں رکھیں، ایک ٹیسٹ سلوشن کے لیے اور دوسرا خالی محلول کے لیے۔
ب ٹیسٹ حل:
1) 10 ملی لیٹر برومیلین اینزائم پاؤڈر محلول کو ٹیسٹ سلوشن کے لیے نامزد بیکر میں شامل کریں، ٹائمنگ شروع کریں اور گھومیں۔
2) 45 ڈگری پر انکیوبیشن کے ٹھیک 20 منٹ کے بعد، 0.1 ملی لیٹر 3 فیصد ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ ڈالیں اور گھومیں۔
3) مزید 5 منٹ کے لیے انکیوبیٹ کریں۔
4) پانی کے غسل سے بیکر کو ہٹا دیں اور مسلسل ہلچل کے ساتھ پی ایچ پروب ڈالیں۔
5) 10 سیکنڈ کے بعد پی ایچ ریکارڈ کریں (ابتدائی پی ایچ)
6) pH 6 میں ایڈجسٹ کریں۔{2}} 0.1 N NaOH کے ساتھ۔ (تقریباً 2-4 ملی لیٹر)
*نوٹ: pH کو 6 پر ایڈجسٹ کرتے وقت۔{1}} pH 5.8 پر محتاط رہیں؛ پی ایچ آہستہ آہستہ بڑھتا ہے اور اس مقام پر NaOH کے منٹ کے اضافے سے pH میں نمایاں اضافہ ہو گا۔
7) مسلسل ہلچل کرتے ہوئے، 10 ملی لیٹر 37 فیصد formaldehyde pH 9.0 شامل کریں۔
8) 10 سیکنڈ اور 1 منٹ کے بعد پی ایچ ریکارڈ کریں۔
9) ٹائٹریٹ to pH 9۔{2}} کے ساتھ 0.1 N NaOH۔
10) ٹائٹریشن والیوم ریکارڈ کریں۔
یہ ٹیسٹ ٹائٹر ہے، T. c.
خالی حل: خالی حل کو ٹیسٹ حل کے ساتھ ساتھ چلایا جانا چاہئے۔ یہ ٹیسٹ سلوشن شروع ہونے کے 12 منٹ بعد خالی حل کے تعین کو شروع کرکے پورا کیا جاتا ہے۔ اس سے آپ کو خالی حل کے ساتھ آگے بڑھنے سے پہلے ٹیسٹ کے حل پر پرکھ مکمل کرنے کا وقت ملتا ہے۔ 1) خالی محلول اور گھومنے کے لیے مقرر کردہ بیکر میں 0.1 ملی لیٹر 3 فیصد ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ شامل کریں۔
2) 45 ڈگری پر انکیوبیشن کے ٹھیک 20 منٹ کے بعد 1.0 ملی لیٹر برومیلین محلول ڈالیں اور گھومیں۔
3) مزید 5 منٹ کے لیے انکیوبیٹ کریں۔
جیلیٹن ہضم یونٹ تجزیاتی طریقہ (GDU) - جاری۔
4) پانی کے غسل سے بیکر کو ہٹا دیں اور مسلسل ہلچل کے ساتھ پی ایچ پروب ڈالیں۔
5) 10 سیکنڈ کے بعد پی ایچ ریکارڈ کریں (ابتدائی پی ایچ)
6) pH 6 میں ایڈجسٹ کریں۔{2}} 0.1 N NaOH کے ساتھ۔ (تقریباً 2-4 ملی لیٹر)* اوپر نوٹ دیکھیں۔
7) مسلسل ہلچل کرتے ہوئے، 10 ملی لیٹر 37 فیصد formaldehyde pH 9.0 شامل کریں۔
8) 10 سیکنڈ اور 1 منٹ کے بعد پی ایچ ریکارڈ کریں۔
9) ٹائٹریٹ to pH 9۔{2}} کے ساتھ 0.1 N NaOH۔
10) ٹائٹریشن والیوم ریکارڈ کریں۔ یہ خالی ٹائٹر ہے، بی۔
F. حساب:
1. تعریف: ایک جیلیٹن ہاضمہ یونٹ انزائم کی وہ مقدار ہے جو 45 ڈگری پر 20 منٹ کے ہضم ہونے کے بعد pH 4.5 یا pH 5.5 (GDU pH 4.5 یا pH 5.5) پر معیاری جلیٹن محلول سے 1 ملی گرام امینو نائٹروجن کو آزاد کر دے گی۔
GDU/g {{0} (TB) x 14 x N x 50 Wt (g) کہاں: T=ٹیسٹ ٹائٹر (ml 0.1 N NaOH) B=خالی ٹائٹر (ml 0.1 N NaOH) N=معیاری NaOH کی نارملٹی (یعنی 0.100) Wt (g)=انزائم کا ابتدائی وزن
جی ٹیسٹنگ پیرامیٹرز:
1. انزائم کی تیاریوں کو تقریباً 0.001 g/ml (1 mg/ml) یا برومیلین انزائم پاؤڈر کے لیے تقریباً 1-2 GDU/ml کے ارتکاز میں پتلا کیا جاتا ہے۔ طریقہ کار کی درستگی کو یقینی بنانے کے لیے ہر رن کے ساتھ ایک حوالہ مواد پرکھا جاتا ہے۔
Guanjie GDU ٹیسٹ کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے، بلک برومیلین پاؤڈر فراہم کرتا ہے۔ ہمارا پیداواری عمل CGMP معیاری ورکشاپس کے تحت کام کرتا ہے، دو فیکٹریوں اور دو آزاد لیبارٹریوں میں تین پروڈکشن لائنوں کا استعمال کرتا ہے۔ ہماری مصنوعات کے بارے میں کسی بھی پوچھ گچھ کے لئے، براہ مہربانی ہم سے رابطہ کریںinfo@gybiotech.com.
